Methoden:(20-40) Patienten mit fortgeschrittenen Carotisplaques (Stadium V bis VII nach AHA) wurden mit dem anfänglichen Stadium (I-III nach AHA) verglichen. Carotisläsionen wurden histologisch charakterisiert und immunhistochemisch die DNA-Methylierung untersucht. DNA-Isolierung aus Formalinpräparaten erfolgte gemäß einem etablierten Protokoll, DNA Bisulfit-Konvertierung mit Qiagen-Kit. Der Zustand der globalen DNA-Methylierung wurde mit spez. Assay (Qiagen) und Primern gegen repetitive DNA-Sequenzen LINE1 und SATalpha bestimmt.

Ergebnisse:Im fortgeschrittenen Stadium der Atherosklerose zeigten alle Carotisplaques einen signifikant verringerten Methylierungszustand (LINE1, SATα) verglichen mit dem anfänglichem Stadium (Reduktion um 40-60%, p < 0,05). Weiterhin wurde eine Verringerung der globalen DNA-Methylierung im Serum der Carotispatienten beobachtet, verglichen mit gesunden Probanden.

Schlußfolgerung:Die DNA-Hypomethylierung korreliert signifikant mit dem Fortschreiten der Carotisatherosklerose. Die Veränderungen der DNA-Methylierung konnten auch im Blut der Patienten mit hochgradigen Carotisläsionen nachgewiesen werden. Somit könnte der Zustand der DNA-Methylierung auch als ein Marker der Plaqueprogression

Es wurden insgesamt 54 Patienten mit hochgradigen Carotisstenosen von über 70% untersucht, die einer Carotis-Thrombendarteriektomie (Carotis-TEA) unterzogen wurden. Histologische Untersuchungen beinhalteten die Plaquemorphologie, die Zellularität, die Plaquestabilität, sowie die Bestimmung der Anzahl der Neogefäße. Immunhistochemisch erfolgte der Nachweis von Makrophagen (CD68), SMCs (SM-Aktin), Endothelzellen (CD31, Faktor VIII) und relevanter angiogenetischer Faktoren (VEGF, VEGFR-2, PDGF, Ang-1, -2). Weiterhin wurden serologisch VEGF, PDGF, Ang-1,  -2, und weitere klinische Parameter (CRP, Fibrinogen, Patientenanamnese) analysiert. Anschließend erfolgte eine quantitative Analyse der Expression der angiogenetischen Faktoren mit Hilfe der Real-Time RT-PCR und eine ausführliche statistische und Korrelationsanalyse.

Instabile Plaques wiesen eine signifikant höhere Anzahl an Neogefäßen und inflammatorischen Zellen verglichen mit stabilen Plaques (Faktor 1,5 / p = 0.021) auf. Die instabilen Läsionen zeigten zusätzlich einen geringeren Kollagen- und Elastin-Gehalt und eine reduzierte Anzahl von glatten Muskelzellen. Die meisten Neogefäße exprimierten alle untersuchten angiogenetischen Faktoren: VEGF, VEGFR-2, PDGF, Ang-1, und -2. Die Expression von VEGF war signifikant erhöht in den instabilen Plaques verglichen mit stabilen Carotisläsionen (1,6-fach / p = 0,039).  Dagegen verringerte sich die Expression von Ang-1 in instabilen Plaques (1,8-fach / p = 0,037). Signifikant höhere VEGF-Konzentration wurde auch im Blut von Patienten mit hochgradigen Carotisstenosen und instabilen Plaques beobachtet (0,32 ± 0,22 ng/mL vs. 0,22 ± 0,16 ng/mL; p = 0,002). Statistische und Korrelationsanalysen zeigten signifikante Korrelationen zwischen der Carotisplaqueinstabilität, der Expression von VEGF in den Plaques und im Blut der korrespondierenden Patienten, der Anzahl an Neogefäßen innerhalb der Plaque und der Akkumulation inflammatorischer Zellen.

Die Ergebnisse zeigen einen klaren Zusammenhang zwischen dem Grad der Neovaskularisierung, Expression von angiogenetischen Faktoren in den extracraniellen Carotisläsionen und der Plaquestabilität. Instabile atherosklerotische Carotisplaques waren signifikant mit einem serologisch höheren VEGF- und niedrigem Ang-2 Spiegel assoziiert. Somit könnten diese Faktoren auch als potentielle Prognosemarker der Plaqueinstabilität bei dem Auftreten einer zerebralen Ischämie dienen.

Das Ziel des Projekts ist deshalb eine systematische Untersuchung von ADAMTS im Zusammenhang mit der Rupturgefährdung extracranieller Carotisläsionen und eine mögliche Korrelation deren Aktivität im Blut als mögliche prognostische Marker schlaganfallgefährdeter Patienten.

Es sollen dabei 10-20 stabile und 10-20 instabile Carotis-Präparate gewonnen werden und histologisch und histochemisch charakterisiert werden (HE, EvG, SM-Aktin, Faktor VIII, CD68, CD45, CD20, CD3). Anschließend erfolgt die eigentliche Untersuchung der ADAMTS- Proteinasen: ADAMTS1, ADAMTS2, ADAMTS3, ADAMTS4, ADAMTS8, ADAMTS9, ADAMTS13 und 14

Die Expression der einzelnen ADAMTS soll mit den einzelnen Zellen innerhalb der atherosklerotischen Läsionen assoziiert und anschließend quantitativ mit Hilfe der RT-PCR bestimmt werden. Weiterhin soll das Blutserum der jeweiligen Patienten auf das Vorkommen/Aktivität der einzelnen ADAMTS untersucht.

Patients and methods:Advanced carotid artery plaques of 40 patients (20 stable and 20 unstable plaques, Virmani classification) and early arteriosclerotic lesions of 3 patients were analyzed using immunohistochemistry and quantitative gene expression analysis of CNP and its receptors and correlated with clinical data.

Results:Expression level of natriuretic peptide receptor 3 (NPR3) was significantly higher in unstable plaques compared to stable plaques (5.6±1.8% vs. 1.7±0.5%, p=0.039, ANOVA). Expression levels of CNP and NPR2 were higher in unstable plaques but the differences were not statistically significant. The distribution pattern of CNP, NPR2 and NPR3 varied between early and advanced carotid plaques but no differences were observed with respect to plaque stability.

Conclusion:This study shows for the first time the presence of CNP and its receptors in atherosclerotic plaques of human carotid artery. Furthermore, our results indicate the modulation of CNP and its receptors in accordance with the degree of atherosclerosis and plaque vulnerability. This suggests that CNP and its receptors may be involved in regulation of plaque formation in humans and might be a possible factor to estimate the risk of plaque rupture in the future.

Methods:Carotid endarterectomy plaques were collected from 114 patients (n=51 with and n=63 without CKD, mean eGFR 49±9 vs. 88±14 mL/min) and analyzed by histology and immunohistochemistry. Serum levels of various clinical parameters, matrix metalloproteinases (MMP-1,-2,-3,-7,-8,-9), blood calcium, phospahate, parathyroid hormone, fetuin A, osteoprotegerin, and inflammatory factors (fibrinogen, hsCRP),  were measured by appropriate ELISA assays

Eine andere Möglichkeit solche iPS zu gewinnen ist die Veränderung der sog. epigenetischen DNA- und Chromatinmodifikationen, indem Proteine ausgeschaltet werden, die die Gene der Pluripotenz stilllegen. Das kann z.B. durch die Inhibierung der DNA-Methylierung durch small interfering RNAs (siRNAs) mit Hilfe von nicht-viralen Vektorsystemen zustande kommen

Das Ziel des Projekts ist die Generierung von iPS Zellen durch gezielte Inhibierung der Expression von Proteinen, welche die Umprogrammierung von ausdifferenzierten somatischen Zellen verhindern (Methylierung). Zu diesem Zweck sollen monozytäre Zellen verwendet werden. Monozyten haben erstens den Vorteil, dass sie relativ einfach und in größeren Mengen aus einem potentiellen Patienten gewonnen werden können. Zweitens sind Monozyten noch nicht vollständig ausdifferenziert und sind in der Lage sich in andere Zellen, wie z.B. Makrophagen oder dendritische Zellen umzuwandeln.

Ziele und Arbeitsprogramm:

–        Optimierung des siRNA-Transfers in monozytäre Zellen (ThP1 und PCMO) mit unterschiedlichen Transfektionsreagenzien (Nachweis mit Fluoreszenzmikroskop, FACS-Analyse (Cy3-siRNA)).

–        siRNA gegen p53 (Tumorsuppressorgen, inhibiert Zellproliferation)

–        siRNA gegen DNMT1, 3A, 3B

–        Nachweis der Inhibierung mit real time RT-PCR und Western Blot

–        Bestimmung der Zellviabilität, Toxizität (LDH) und Zellproliferation (MTT).

–        Bestimmung der DNA-Methylierung (LINE1, Alu1)

–        Bestimmung der Expression der iPS-bestimmenden Faktoren (Oct4, KLF4, Sox2, Nanog, c-Myc) mit Hilfe von real-time RT-PCR und/oder Western Blot

Aim of the study:Inhibition of various epigenetic enzymes by using chemical compounds: aza (5-aza-deoxycitidine, bix (BIX-01294; diazepin-quinazolin-amine derivative), va (valporic acid) to reprogram adipose-derived mesenchymal cells (mesoderm) to achieve pluripotency.

Working program:

–        Isolation and cultivation of adMSCs

–        Characterisation of adMCSs

–        Treatment of adMSCs with different concentrations of aza, bix, and va, determining the cell viability (MTT) under different conditions and at various time points

–        Determination of DNA-Methylation status (LINE1, Alu1) – searching for optimal working conditions

–        Optimisation of real-time RT-PCR for pluripotency markers (c-Myc, Sox2, Klf4, Oct4 Nanog)

–        Testing of expression of pluripotency markers following treatment with aza, bix, va

–        Determination of telomere length and telomerase activity

Methods:Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ad-MSCs) were isolated from abdominal adipose tissue (n=6) and were characterized morphologically and by FACS analysis. Cells were treated with various amounts of AZA, BIX, or VPA for up to three days. The optimal sub-toxic concentrations were assessed by cell viability assay (MTT). Global DNA methylation was determined by MethyLight application, expression of pluripotency genes by SYBRgreen-based real-time PCR.

Results:The isolated ad-MSCs revealed a homogenous population of cells (>84%) positive for CD90, CD105 and negative for CD14, CD45 (<1.8%). The subtoxic concentrations of AZA, BIX, and VPA were: 2.5µM, 0.1µM, and 0.1mM, respectively. Following treatment of ad-MSCs, DNA methylation status of LINE1 was significantly reduced by BIX to 30%, by AZA to 50% compared to DNA methylation of non-treated cells (p<0.05). Regarding individual donors, all three epigenetic modifying drugs were able to significantly increase the expression of Nanog and Oct4. Nanog was increased for up to 3.0-fold (BIX), 2.5-fold (AZA), and 1.4-fold (VPA), Oct4a for up to 5.2-fold (BIX), 1.8-fold (AZA), and 8.1-fold (VPA). Using statistical mean of all donorsonly BIX led to a significant increase in the expression of Nanog and Oct4 (1.7- and 3.1-fold, p<0.05).

Conclusions:BIX seems to be an efficient epigenetic modifier inducing expression of pluripotency genes.

Zielsetzung: Insgesamt soll eine Therapiemöglichkeit geschaffen werden, chronische Ulcera mit einem aus körpereigenen Zellen hergestellten, optimierten Autotransplantat zur Abheilung zu bringen. Zu diesem Zweck wurden PCMO aus freiwilligen Probanden gewonnen und unter verschiedenen Zellkulturkonditionen gezüchtet. Es wurde dabei der Wachstum der Zellen bestimmt und weiterhin wurden diese Zellen charakterisiert. Die Differenzierung erfolgte mit Hilfe eines geeigneten kommerziell erhältlichen endothelialen Mediums.

Die Gewinnung und Kultivierung von PCMO wurde etabliert. Die besten Wachstumskonditionen wurden mit Hilfe des autologen Serum und mit Verwendung von Wachstumsfaktoren IL-3 und M-CSF erzielt. Die Zellen haben sich jedoch überwiegend in Makrophagen ausdifferenziert, was morphologisch, immunhistochemisch und mit Hilfe von Western Blot (CD68) nachgewiesen werden konnte. Die Expression der Endothelzellmarkers CD31 und Faktor VIII wurde zwar beobachtet, diese Faktoren wurden jedoch ebenfalls bei den nicht ausdifferenzierten Monozyten beobachtet. Weitere Faktoren, wie VEGF, VEGFR2, VCAM (CD105) und VE-Catherin (CD144) konnte gar nicht oder nur sporadisch beobachtet werden.

Zusammenfassung: PCMO lassen sich unter den etablierten Zellkulturkonditionen gut kultivieren. Die besten Ergebnisse wurden mit autologem Serum erzielt. Leider differenzieren PCMO zu Makrophagen und lassen sich nicht ausreichend mit Wachstumsfaktoren wie IL-3 und M-CSF dedifferenzieren, um daraus vaskulären Zellen zu generieren.

Design:Aortic vessel wall of AAA patients (n = 20) and non-aneurysmal aortic specimen (n = 10) were obtained by conventional surgical repair and autopsy. SYBR green-based real-time PCR, histology and immunohistochemistry were performed on the samples.

Results:Normalising of ADAMs against their inhibitors demonstrated significantly increased activity of ADAM 10 and 15 in AAA compared to control aorta (P < .05). Significant positive correlation was observed between ADAM 10, 12, 15, 17, TIMP-3 and SMCs. SMCs, neovessels, and macrophages were positive for all ADAMs and TIMPs tested. Infiltrates showed the same expression pattern but were negative for TIMP-3, luminal ECs were positive for ADAM 15 and 17.

Zu diesem Zweck wurden in die Studie insgesamt 40 Patienten mit einem abdominalen Aortenaneurysma, die einer offenen Aneurysmaoperation unterzogen worden waren, und 10 Kontrollpersonen einbezogen. Das intraoperativ entnommene Gewebe wurde entweder sofort in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet oder frisch tiefgefroren. Außerdem wurde den Patienten präoperativ das Blut für die Serumuntersuchung entnommen. Die Gewebeproben wurden hinsichtlich ihres histologischen Aufbaus anhand histologischer und immunhistochemischer Färbungen charakterisiert. Dabei wurden die Zellularität, Entzündungsinfiltrate und das Vorhandensein von Elastin, Kollagen, Makrophagen, medialer glatter Muskelzellen, Neovaskularisierung, sowie das Ausmaß atherosklerotischer Plaques und Verkalkung beurteilt. Immunhistochemische Färbungen wurden für die Cathepsine B, D, K, L und S, sowie für Cystatin C durchgeführt und deren Expression in luminalen Endothelzellen, medialen glatten Muskelzellen, Makrophagen, Lymphozyten der Entzündungsinfiltrate und Endothelzellen und glatten Muskelzellen von reifen, bzw. unreifen Neogefäßen semiquantitativ erfasst. Zur quantitativen Analyse der Expression von Cathepsinen und Cystatin C wurden die quantitative SYBRGreen-basierte Real-Time RT-PCR sowie die Western Blot Analyse durchgeführt. Serumproben wurden auf das Vorkommen von Cathepsinen und Cystatin C mittels Immunpräzipitation und anschließender Western Blot Analyse untersucht.

In den immunhistochemischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Cathepsine und Cystatin C von fast allen Zellen der AAA-Gefäßwand exprimiert wurden, insbesondere von Makrophagen, Lymphozyten, sowie den Zellen der Neogefäße. Beim histologischen Vergleich zwischen symptomatischen und asymptomatischen AAA zeigte sich bei den symptomatischen Aortenaneurysmen zum einen ein stärkerer Verlust an medialen glatten Muskelzellen sowie kollagenen und elastischen Fasern, zum anderen ein vermehrtes Vorkommen von Makrophagen und inflammatorischen Infiltraten. Hinsichtlich der Expression von Cathepsinen und Cystatin C waren in den immunhistochemischen Untersuchungen zwischen symptomatischen und asymptomatischen AAAs jedoch keine signifikanten Unterschiede zu verzeichnen. Dies konnte auch mit der quantitativen Real-Time RT-PCR bestätigt werden. Hingegen war beim quantitativen Vergleich zwischen AAA und Kontrollaorten die mRNA-Expression von Cystatin C (p=0,002), sowie Cathepsin D (p<0,001) und K (p=0,018) in den Aortenaneurysmen signifikant vermindert. In der Western Blot Analyse zeigten sich die zu erwartenden Banden für Cathepsin B bei 31 kDa, für Cathepsin D bei 34 kDa, für Cathepsin L bei 34 kDa, für Cathepsin S bei 25 kDa und für Cystatin C bei 16 kDa. Im Serum der AAA-Patienten konnten mittels der Immunpräzipitation Cathepsin B und Cystatin C nachgewiesen werden.

Obwohl es in den verschiedenen Zellen der AAA-Gefäßwand zu einer erhöhten Expression von Cathepsinen verglichen mit den Kontrollaorten kommt, war interessanterweise die Cathepsin-Expression in ihrer Gesamtheit in AAA-Präparaten mengenmäßig reduziert. Das im AAA bestehende Ungleichgewicht zwischen Cathepsinen und Cystatin C hat somit seine Ursache weniger in der Hochregulierung der Cathepsin-Expression auf transkriptionaler  Ebene, sondern vielmehr in einer Herunterregulierung des Inhibitors Cystatin C. Dass es trotz erhöhter Expression der Cathepsine in den einzelnen Zellen zu einer insgesamt verminderten Menge an Cathepsinen in AAA kommt, hat seine Ursache möglicherweise in dem ausgeprägten Verlust an medialen glatten Muskelzellen, die außer inflammatorischen Zellen die Hauptquelle der Cathepsine darstellen. Mit Hilfe der Western Blot Analyse konnte außerdem nachgewiesen werden, dass alle untersuchten Cathepsine im AAA in der aktiven Form vorkommen, ein weiteres Indiz für deren wichtige Rolle bei den proteolytischen Vorgängen im Rahmen der AAA-Pathogenese.

Methods and Results:Thirty-four consecutive patients who underwent atherectomy of the superficial femoral artery using the SilwerHawk atherectomy device (ev3 Europe SAS, Paris) and 10 patients with asymptomatic carotid artery stenosis who underwent carotis thrombendatherectomy were included in the study. Microscopic sections were analyzed blindly on a semiquantitative scale after the following stainings: hematoxylin eosin, Elastica van Gieson, anti-CD31, anti-CD68, anti-CD3, anti-CD15, anti-SMC actin, anti-CD61 and Sudanred. The amount of local haemorrhage, thrombus formation, platelet deposition or smooth muscle content was similar in the femoral and carotid lesions. Calcifications were significantly increased in the femoral atherectomies (P=0.02), whereas lipid content and foam cells were increased in carotid samples (P=0.001, P=0.09). Similarly vascularization and the number of infiltrating monocytes were more pronounced in the carotid as compared to the femoral lesions (P=0.001, P=0.01). The number of infiltrating lymphocytes and neutrophils was comparable in both groups.

Conclusion:Carotid atherectomy lesions contain more lipids, infiltrating monocytes and vessels whereas femoral samples have more calcification. Better understanding of the local differences of atherosclerosis may aid to improve prevention and treatment of atherosclerosis and its complications.

Ziel der Studie ist es, das Chemokin Fractalkine in einem Tiermodel (ApoE-Maus) und auch im menschlichen Plaquegewebe und im Blut nachzuweisen. Vorhandene Proben (Plaquematerial, Blutprobe) sollen entsprechend untersucht werden. Mäusegewebe und humanes Plaquematerial soll durch histologische (Hämalaun/Eosin, Elastika van Gieson) immunohistochemische (CD31, CD68) Methoden gefärbt werden. Zusätzlich soll die Expression von Fractalkine und dessen Rezeptor in der Gefäßwand und Blutserum nachzuweisen.